Caractérisation morphologique et cytogénétique de deux lignées d'Arabidopsis thaliana déficientes pour PMS1, une protéine du système de correction des mésappariements

Le système de correction des mésappariements (MMR) des eucaryotes est responsable de la correction des erreurs de réplication de l'ADN et intervient dans la recombinaison méiotique. AtPMS1, un gène du MMR chez Arabidopsis thaliana, est impliqué dans la correction des mésappariements, mais son rôle méiotique n’a pas encore été déterminé. Nous avons caractérisé deux lignées mutantes pour le gène AtPMS1. Une lignée présente une morphologie florale aberrante qui est probablement indépendante de l’inactivation d’AtPMS1 mais serait plutôt attribuable à un phénomène de cosuppression. La seconde lignée présente plusieurs phénotypes vraisemblablement causés par l'inactivation d’AtPMS1 : une baisse de fécondité de 65 à 80 %, une ségrégation biaisée de l'allèle mutant et des anomalies cytogénétiques chez 16 % des microsporocytes (fragmentation et ségrégation anormale des chromosomes). Le biais de ségrégation n’a encore jamais été observé chez les autres eucaryotes et semble particulier aux homologues de MutL chez A. thaliana ou chez les plantes.The eukaryotic DNA mismatch repair system (MMR) is responsible for the repair of replication errors, and plays a role in genetic recombination. AtPMS1, a MMR gene from Arabidopsis thaliana, has already been shown to play a role in DNA repair but its involvement in meiosis has yet to be examined. We characterised two lines of insertional mutants at AtPMS1. A first mutant line has abnormal flowers, which is probably a phenotype unrelated to the loss of AtPMS1 activity but rather caused by cosuppression. The second mutant line shows many phenotypes, likely linked to AtPMS1 inactivation: a 65 to 80% reduction in seed production, an abnormal segregation of the mutant allele and cytogenetic abnormalities in 16% of the microsporocytes (chromosome fragmentation and missegregation). The observed bias in segregation as not been observed in other eukaryotes, and seems to be a particularity of MutL homologues in Arabidopsis or plants as a whole

Étude du rôle des thiorédoxines f dans la mort cellulaire programmée et en réponse à divers stress abiotiques chez la plante modèle Arabidopsis thaliana

La mort cellulaire programmée, ou MCP, est un processus dynamique où les cellules ont la capacité de déclencher et de contrôler leur propre mort. Elle est essentielle et présente chez tous les organismes multicellulaires. Chez les plantes, la MCP permet le développement optimal (ex : formation du xylème, morphologie des feuilles, etc.) de la plante tout en protégeant contre divers stress biotiques et abiotiques (ex : la sécheresse, la chaleur, les UV, etc.). Malgré les avancées de ces dernières années, peu de gènes impliqués dans la mise en place de la MCP induite par les UV-C ont été identifiés chez les plantes. L'objectif était donc de caractériser ces gènes chez Arabidopsis thaliana. L'un des candidats est le gène BI-1, pour Bax Inhibitor-1. Il code pour un facteur anti-apoptotique de la MCP animale également retrouvé chez Arabidopsis thaliana. BI-1 régule aussi le taux de calcium du réticulum endoplasmique, ainsi que la formation des espèces réactives de l'oxygène (ROS), permettant l'activation de la réponse de la cellule au stress. L'expression de ce gène suite à une exposition aux UV-C est augmentée, faisant de lui un candidat pour la réponse aux UV-C. Une fusion du promoteur du gène AtBI-1 au gène rapporteur de la luciférase (pAtBI-1::luciférase) a été insérée dans le génome d'Arabidopsis. Une plante homozygote pour l'insertion de l'ADN-T, 5PL20E, a été isolée. Cette lignée parentale a été ensuite mutagénéisée, et un crible effectué sur la descendance exposée aux UV-C a permis d'identifier un mutant, 2017, dont l'expression de la luciférase était modifiée. Le premier objectif de ce projet était de caractériser ce mutant et de déterminer le lien potentiel avec la régulation de BI-1. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés aux rôles des thiorédoxines (TRX) dans la MCP végétale. Ces protéines sont présentes chez tous les organismes vivants. Elles régulent les activités de beaucoup d'enzymes en réduisant leurs ponts disulfures. Peu représentées chez l'homme (deux gènes), elles ont néanmoins un rôle de protection dans la voie de signalisation de l'apoptose. Par contre, chez Arabidopsis, une vingtaine de gènes codant pour les thiorédoxines sont connus. Suite à un autre crible aux UV-C d'une banque de mutants d'insertion, un nouveau mutant pour lequel l'insertion de l'ADN-T était dans le promoteur du gène codant pour la thiorédoxine f1 (AtTRX f1) a été identifié. Chez Arabidopsis, deux gènes codent pour les TRX f. Ces protéines ont d’abord été étudiées en tant que régulateur d’enzymes du cycle de Calvin. Plus récemment, d’autres fonctions ont été attribuées, surtout à la TRX f1. Nous avons obtenu de simples mutants pour les deux gènes et produit par croisement des doubles mutants, pour étudier l'implication des TRX f dans la MCP végétale induite par les UV-C (ultraviolets de type C), le MV (methyl viologen) et l'ABA (acide abscissique). En parallèle, des surexpresseurs de la TRX f1 ont été analysés pour ces mêmes stress abiotiques. L'objectif était de déterminer s'il y a une redondance de fonction entre les deux gènes, puisque ces deux protéines, de la même sous-famille, sont localisées au niveau des chloroplastes. Suite à une induction de la MCP par l'un des stress abiotiques, les réponses observées chez les simples mutants sont similaires à celles des plantes sauvages. Par contre, les doubles mutants paraissent plus résistants aux divers stress, alors que les surexpresseurs semblent nettement plus sensibles que les plantes sauvages. Enfin, un dernier axe a été développé sur le rôle des TRX f dans le contrôle des voies de synthèse et de dégradation de l'amidon pour l'ensemble des plantes de notre essai. Il s'avère que les surexpresseurs produisent une plus grande quantité d'amidon que les plantes sauvages. À l'opposé, les simples mutants ont moins d'amidon au niveau des différents tissus étudiés que les plantes sauvages, et les doubles mutants n'en présentent quasiment pas. La présence d'une quantité plus importante d'amidon chez les surexpresseurs de TRX f influence la sensibilité de ces plantes aux stress abiotiques. À l'inverse, les doubles mutants sont plus résitants à ces mêmes stress, où cette quantité d'amidon est fortement diminuée pour ces plantes

Crible de mutants de la mort cellulaire programmée chez Arabidopsis thaliana

Dans le but d'apporter notre contribution à une connaissance plus large de la mort cellulaire programmée (MCP) végétale, ce projet de doctorat avait pour objectif d'identifier des gènes régulés par les UV-C et potentiellement impliqués dans la mise en place de la MCP chez Arabidopsis thaliana . La première approche expérimentale développée a consisté à mettre au point un outil permettant l'identification de facteurs régulant la MCP. Ceci a été réalisé à travers la mise au point d'un crible de mutants d'A. thaliana transformés avec le gène de la luciférase sous contrôle du promoteur du gène AtBI-1, impliqué dans la MCP. Parmi les plantes transformées, la lignée 4MD03 a été sélectionnée sur la base du niveau d'expression du gène de la luciférase. Des mutations ponctuelles et aléatoires à l'EMS (ethylméthane sulfonate) ont été générées par la suite afin d'isoler des mutants dérégulés dans des voies de signalisation menant à la MCP. Parallèlement à la mise au point du crible, l'analyse fonctionnelle de la région promotrice du gène AtBI-1 a été initiée à travers une série de délétions, afin d'identifier des éléments essentiels pour la régulation de l'expression de ce gène dans des conditions de MCP. Ces délétions fusionnées au gène rapporteur GUS ont été introduites dans A. thaliana et ont permis d'identifier la région responsable de la régulation du promoteur. Enfin, une collection de mutants d'A. thaliana contenant le gène de la luciférase, sans promoteur, a été criblée en utilisant les UV-C comme inducteur de MCP. Ce crible a permis d'identifier la lignée TL-72H qui présente une insertion dans la région 5'UTR du gène Trx f1, un gène codant pour une thioredoxine chloroplastique. Ce gène est fortement réprimé suite au traitement aux UV-C et son expression dans le mutant TL-72H est fortement réduite par la présence de l'insertion. Les différentes expériences réalisées ont permis de montrer que le gène Trx f1 a un impact sur le niveau de mortalité des plantules en réponse aux UV-C. La perte précoce d'expression de ce gène dans le mutant entraîne une MCP plus importante suite à un traitement aux UV-C. De plus, la protéine Trx f1 est capable d'atténuer la mort induite par le facteur pro-apoptotique Box dans la levure. Enfin, le mutant TL-72H se révèle plus sensible au methyl viologen, un herbicide qui induit la MCP à travers la production de ROS au niveau des chloroplastes. Tous ces résultats suggèrent pour la première fois que Trx f1 pourrait être impliqué dans la MCP chez les plantes à travers un possible contrôle de la production de ROS par les chloroplastes

Étude génétique de la neurofibromatose de type 1 : diagnostic moléculaire et recherche de mutations

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie autosomique dominante. Elle affecte toutes les ethnies avec une incidence de 1 pour 3500 naissances. 50% des cas sont d'origine familiale et 50% sont sporadiques. L'expression de cette maladie est très variable et la fréquence des mutations nouvelles est très élevée, ce qui pose un problème dans le diagnostic clinique. En effet, le diagnostic moléculaire grâce à l'étude de linkage des haplotypes avec des marqueurs de polymorphismes de l'ADN est la solution pour les cas familiaux. Par contre pour les cas sporadiques, l'identification des mutations liées à la maladie est la seule solution. Dans ce travail, nous avons analysé les haplotypes de neuf familles NF1 de la province de Québec en utilisant des marqueurs très informatifs de type microsatellites et un marqueur RFLP. Ces marqueurs nous ont permis d'identifier l'allèle mutée et par conseéquent un diagnostic présymptomatique ou prénatal partiel de la maladie NF1 est possible. Grâce à ces marqueurs, il a été possible d'identifier deux délétions dues à une perte d'hétérozygotie chez deux familles. Chez huit individus NF1 sporadiques, nous avons analysé les produits d'amplification de tout l'ADNc par RT-PCR afin d'éviter d'analyser l'ADN génomique de NF1 qui est de grande taille et dans le but d'identifier les mutations de délétions ou d'insertions. Nous avons aussi essayé de mettre au point une technique de détection des mésappariements de bases par l'enzyme résolvase afin d'identifier les mutations ponctuelles du gène NF1. [Résumé abrégé par UMI

Caractérisation d'Ahi-1, une nouvelle protéine impliquée dans la signalisation du lymphocyte T

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal